2022年6月8日，耶鲁大学生物医学工程系樊荣教授团队联合宾夕法尼亚大学J. Joseph Melenhorst，Pablo G. Camara，Carl H. June和Stephan A. Grupp团队在Science Advances上发表了题为Single-cell antigen-specific landscape of CAR T infusion product identifies determinants of CD19-positive relapse in patients with ALL的研究论文，对从2012年在宾夕法尼亚大学医学院和费城儿童医院启动的全球首批临床试验中12名复发/难治性B-ALL病人的总计超过10万个回输前（Pre-infusion）4-1BB结构CAR-T细胞进行了单细胞精准分析，揭示了Th2功能在CD19阳性复发病人中的缺失。该结果进一步通过独立的流式分析和IsoPlexis分泌蛋白检测在49名病人的CAR-T功能特性表征中得到了验证。耶鲁大学白志亮博士和宾大Steven Woodhouse博士为该论文的共同第一作者。根据患者的临床反应，研究人员将12名患者分为长期完全缓解组（超过54个月无复发，n = 5），CD19阳性复发组（中位复发时间=9.6个月，n = 5）和无响应组（n = 2），获取了CAR-T细胞在未激活、CD19抗原特异性激活、T细胞受体激活和非靶点激活条件下的全基因转录组和14种表面蛋白组信息。通过细胞因子共表达模块分析，研究团队首先发现在抗原特异性激活条件下， Type 2 （Th2）细胞集中分布在CR组CAR-T富集的区域，且Th2模块在CR组中的比例显著高于RL组。高度差异表达基因分析进一步识别到了Th2相关细胞因子IL4、IL5、IL13在CR组的上调和Th2 pathway的显著激活。接下来，对CR和RL病人CAR-T细胞集的聚类分析识别出8个具备独特转录组特征的亚群，其中亚群4中的细胞具有突出的Th2功能。通过细胞占比统计，发现CR组CAR-T在亚群4中的比例显著高于RL组。此外，从IL4、IL5、IL13以及主导Th2细胞分化的转录因子GATA3的单细胞表达分布点状图中可以看出，无论是表达水平还是表达频率，CR组5名病人都明显高于RL组。
为了验证上述发现，团队额外表征了49名B-ALL病人的CAR-T细胞，其中26名病人具备中位33.7个月的无复发完全响应，另外23名病人在中位9.3个月发生CD19阳性复发。双方研究人员独立开展了胞内流式分析（宾大）和IsoPlexis自动化分泌蛋白检测（耶鲁），两种方法共同证实了Th2功能在RL组中的缺失。该项研究通过细胞因子共表达模块、无监督学习聚类和经典信号通路分析从激活CAR-T的功能异质性中识别出了Th2功能在维持CAR-T长久缓解中的重要作用，揭示了当前CAR-T细胞免疫疗法领域十分关切的CD19阳性复发机制，为临床实践中预测响应和筛选病人提供了目标基因、明确了关键通路，也为提高CAR-T功效和改善治疗效果提供了理论基础。http://doi.org/10.1126/sciadv.abj2820
